CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit

細胞增殖與示蹤檢測試劑盒

產品關鍵詞：

CFDA, SE；Calcein AM 鈣黃綠素；Cell Division 細胞分化（分裂）；Fluorescein diacetate (FDA)；PKH26；CAS NO：150347-59-4；

產品信息

【溫馨提示】：見我司懋康生物（maokangbio）提供的CFDA SE 超純凍干粉末（#MX3009-5MG）。

【溫馨提示】：見我司懋康生物（maokangbio）提供的PKH26紅色熒光探針用于常規細胞膜標記（#MX4021-100UL）。

產品描述

CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒（CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit）是一款基于熒光探針CFDA, SE，用于細胞增殖檢測和細胞熒光示蹤的檢測試劑盒。此方法目前廣泛替代MTT法或者3H-胸腺嘧啶核苷摻入法（3H-thymidine incorporation）等細胞增殖檢測方法。本試劑盒包含粉末形式的CFDA, SE探針，細胞培養級的溶劑，以及細胞標記液，使用方便，操作簡單。按照每個樣本的標記體積為1ml來算，我司（懋康生物）提供兩種規格的試劑盒，分別可檢測500個和1000個樣品。

CFDA, SE，英文全名5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CAS NO. 150347-59-4，是一種穩定的、細胞膜滲透性的非熒光染料，由兩個醋酸基團和一個琥珀酰亞胺酯（SE）官能團組成的一個熒光分子。一旦主動擴散進入細胞，其醋酸基團被胞內酯酶切割，生成熒光素酯CFSE。CFSE具有高度熒光，且能通過其琥珀酰亞胺酯基團共價結合到細胞內的蛋白氨基基團。正是這個共價偶聯反應，CFSE能夠極其長期的保留在細胞內，長達數個月。另外，歸因于這一穩定連接，一旦染料進入細胞，不會轉移到鄰近細胞。無活力細胞仍然是非熒光。而活細胞一旦分化，CFSE能夠很均勻的分散到子細胞中，每分裂一次子代細胞約能得到親本細胞1/2的熒光強度，因此，通過流式細胞儀對熒光強度的檢測，能夠依次分選出未分裂細胞，分裂一次的細胞（1/2熒光強度），分裂兩次的細胞（1/4熒光強度），分裂三次的細胞（1/8熒光強度），以及以此類推其他分裂次數的細胞。CFSE可以檢測分裂多達8次或更多次數的細胞增殖。

CFSE廣泛用于細胞增殖和體內細胞示蹤研究。CFSE的最大激發和發射波長分別為492nm和517nm，標記細胞后呈綠色熒光。使用流式細胞儀檢測可用FL1檢測通道。也能用熒光顯微鏡觀察，使用FITC濾片。

產品包裝

保存與運輸方法

保存：-20oC保存，開封前1年有效，其中組分A（CFDA SE粉末）需嚴格避光，組分B避免強光照射。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   CFDA SE溶劑在低溫（如4℃，冰?。┑葪l件下會凝固而粘在離心管底、管壁或蓋子上，可將其置于25℃溫育片刻直至全部融解后使用。

2）   CFDA SE粉末經溶劑溶劑配制成儲存液后一個月內用完最好，最多不超過三個月。因CFDA SE容易被水解，并在水溶液中變質。使用過程中盡量避免接觸水。而在標記過程中接觸到水是在允許范圍內。

3）   熒光染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光，以減緩熒光淬滅。

4）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.      CFDA SE儲存液（1000X）制備

a）   將低溫保存的CFDA SE粉末置于室溫回溫至少20min，之后短暫低速離心，讓所有粉末都掉落至管底。同時也提前將CFDA SE溶劑置于室溫或25℃水浴片刻直至充分融解。

b）   吸取一定量CFDA SE溶劑（比如400μl）到CFDA SE粉末中，充分溶解，短暫低速離心，之后全部轉移到剩下的CFDA SE溶劑中，混勻后，此即為CFDA SE儲存液（1000X）。此配制過程需要避光。

c）   按照單次用量分裝，用鋁箔紙包好后，置于≤-20℃避光干燥保存，最好一個月內用完，最長不超過三個月。-70℃保存能適當延長保存周期。

2.      CFDA SE標記液（1X）制備

準備適量無菌的細胞培養級去離子水，根據實驗需要用量，配制適量的CFDA SE標記液（1X）。比如，取10ml 細胞標記液（10X），加入90ml 去離子水，充分混勻后，即得到CFDA SE標記液（1X），短期置于4℃保存，長期不用可置于-20℃保存。

3.      染色步驟

a）   室溫300×g離心細胞5min，吸掉上清。

b）   PBS或其他生理緩沖液清洗細胞以去除任何殘留的血清蛋白。之后再同上離心吸掉上清。

c）   用1ml CFDA SE標記液（1X）重懸細胞，調整密度為1-5 x 106cells/mL，轉移到15ml離心管內。

d）   用CFDA SE標記液（1X）將CFDA SE儲存液（1000X）稀釋到2X。比如，取2μl CFDA SE儲存液（1000X）到1ml CFDA SE標記液（1X），混勻后即為CFDA SE儲存液（2X）。

e）   將1ml CFDA SE儲存液（2X）加入到步驟c）中含1ml 待標記細胞的15ml離心管內，輕輕混勻。

f）    37℃避光孵育15min?！揪唧w的孵育時間可根據實際情況做適當調整，常用孵育時間10-30min?！?/span>

g）   立即加入10ml完全細胞培養液（含血清）來淬滅染色過程，室溫顛倒幾次混勻。

h）   室溫離心去上清，再用5-10ml完全細胞培養液清洗一次。

i）    再加入5-10ml完全細胞培養液，37℃孵育5min，以促進CFDA, SE在細胞內的充分反應和未反應的CFDA, SE重新回到完全細胞培養液中。離心去上清，完成最后一次清洗。

j）    之后用完全細胞液重懸細胞，此時可用熒光顯微鏡（Ex/Em=492/517nm，FITC濾片）或流式細胞儀（FL1通道）來觀察標記效果?；蜷_始用藥物刺激處理或繼續常規培養。經適當時間后用流式細胞儀檢測細胞增殖，或用于特定目的的細胞示蹤。標記細胞也可用于活體動物的移植，并用熒光進行示蹤。標記的細胞呈綠色熒光。

常見應用和數據示例：

根據熒光信號的稀釋來檢測細胞增殖和分化（示蹤）（Cell proliferation and cell division by Dye Dilution Method），此方法主要用來體內外檢測淋巴細胞（T細胞和B細胞）的增殖，也能用來檢測NK細胞，成纖維細胞甚至細菌。也有用來研究可移植造血干細胞的增殖。

示例1（體外）.

Fig 1. Murine CD4+lymphocytes, labelled with CDFA-SE were cultured with antigen-presenting cells with different peptides to stimulate either the memory or the memory and na?ve cells. Up to five cell divisions can be observed.

示例2（體內）.

Fig 2. Ability of CFSE-labeled ovalbumin (OVA)-specific T cell receptor transgenic CD8+ OT-I T cells, when adoptively transferred into C57BL/6 mice to respond to OVA, data shown 3 days after adoptive transfer. Left panel: CD8+, CD45.1+ OT-1 T cells in recipient mice. Right panel: CFSE proliferation profile. Note non-divided population of CD8+ T cells in recipient mice not receiving antigen (light grey histogram) and auto-fluorescence of non-labeled lymphocytes (dark grey histogram). The Figure depicts CD8+ T cells that have divided 1-6 times based on CFSE dilution peaks. [Quah BJ et al. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. 2010 Oct 12;(44).]

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