CCK-8 Frequently Asked Questions:

1. CCK-8與其他細胞增殖-毒性檢測方法的優勢在哪里？

2. 單孔接種多少個細胞？

當使用96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔（100μL培養基）。檢測白細胞的靈敏度相對較低，因此建議接種量不低于2500個/孔（100μL培養基），建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量。若使用24孔板或6孔板，請先計算每孔相應的接種量，然后按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8。

3. 如何設定空白對照？

在不含細胞的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗（細胞毒性實驗）時，還應考慮藥物的吸收，可以在不含細胞、加入藥物的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度作為空白對照。

4. 哪些物質會影響CCK-8的測定？

當有還原性物質存在時會增加CCK-8的測定，增加OD值；當有氧化性物質存在時會抑制測定反應的發生，降低OD值。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

5. 做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

有時會有影響。如果藥物具有還原性就會和CCK-8發生顯色反應，增加OD值。解決方法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含藥物的培養基（只加CCK-8）的吸光度高，則說明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

6.   CCK-8對細胞的毒性大小如何？

CCK-8對細胞毒性相當低，同樣的細胞在CCK-8檢測后還可用于其他細胞增殖的檢測實驗，比如結晶紫檢測法，中性紅檢測法或DNA熒光檢測法等。由于每種細胞對CCK-8的耐受力不同，因此若需要長時間孵育，先檢測下細胞在加入CCK-8后的活力。

7. 如果沒有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

還可使用430-490nm之間的濾光片，但450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

8. CCK-8能否對活細胞進行染色？

不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性四唑鹽（WST-8），并通過電子載體1-methoxy PM將活細胞中的電子交換到培養基中的WST-8上，因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的，不會進入細胞內，所以CCK-8不能對活細胞進行染色。

9.  須設定參比波長？設定參比波長的目的是什么？

不一定，CCK-8在參比波長處沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁產生的吸收。

10. 每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能存在以下幾個原因：a）當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。通常情況最外一圈孔只加培養基，不作為測定孔用；b）有可能因為CCK-8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK-8，輕輕敲擊培養板以幫助混勻；c）每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1000~100,000個/孔范圍內摸索條件。

11. 如果OD值太低，可以采取什么辦法？

可采取2種辦法：a）適當增加細胞數量；b）延長加入CCK-8后的孵育時間。

12. 如果OD值太高，但不能減少細胞數量，如何解決？

可以縮短加入CCK-8后的孵育時間。比如，可以把加入CCK-8后的孵育時間由原來的3h縮短到2h。

13. CCK-8顯色過程種如何終止反應？

有以下幾種方法（96孔板）：a）顯色反應后，將培養板置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反應終止后請在24h內測定OD值。

14. 必須預培養細胞嗎？

不一定。如果需要保持細胞的最佳狀態，建議預培養細胞。如果不做預培養，細胞內的脫氫酶可能會不穩定。有的科研人員不做預培養，但做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

15. 預培養后，更換培養基需要細胞計數嗎？

一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞，用血球計數板計數，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話，可以預培養后取培養基用血球計數板進行計數。

16. CCK-8對于不同的細胞靈敏度是否一樣？

不一樣。懸浮細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8后1-4h吸光度已經很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的染色時間或增加細胞數量來解決。

17. 懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別？

懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。 

18. 應該每次做標準曲線嗎？

建議每次都做。雖然細胞相同，但是細胞狀態不一樣。對于狀態不一樣的細胞建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能有輕微的差異，此時也建議分別做標準曲線。

19. 實驗之前是否需要先檢測以下培養基和CCK-8之間是否有反應？

建議使用一個孔做下檢測，因有時培養基種可能含氧化還原物質。正式實驗之前有必要先確認下培養基和CCK-8是否有反應。一般正常的OD值應該在0.4以下。

20. 有時在藥物作用下，細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數量？

不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反應活細胞數量。如果細胞已經死亡，即使脫氫酶的活性還有，測定出來的細胞數量將會比真實值高，不能反應真實的活細胞數量，建議采用別的方法測定。

21. 可否使用384孔板進行實驗？

可以。向每孔加入培養基總體積10%的CCK-8。如果加入CCK-8體積太少，可以先將CCK-8稀釋一倍，然后加入培養基總體積20%的量。

22. CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性？

有。但請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此，結果可能不同。

23. CCK-8能否檢測細菌細胞？

可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。向每孔100μL大腸桿菌培養液中加入10μL CCK-8，培養1-4h或過夜。

24. 如果加入藥物中含有金屬，是否有影響？

金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅分別會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使得靈敏度降低。如果終濃度是10mM，將會100%抑制。

25. CCK-8的穩定性如何？

CCK-8在2-8℃能穩定保存1年，推薦用此方法檢測；長期不用也可置于-20℃穩定保存2年。

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